乳酸菌發(fā)酵果汁,又稱水果酵素,是一種利用乳酸菌發(fā)酵鮮果而成的飲品。乳酸菌發(fā)酵果汁過(guò)程中產(chǎn)生的有機(jī)酸、醛類、醇類和羧酸類等芳香成分,可改善其口感風(fēng)味[1],且有文獻(xiàn)表明:乳酸菌發(fā)酵可促進(jìn)植物細(xì)胞壁降解[2-4],有利于細(xì)胞中有效成分如抗氧化物質(zhì)的釋放,增強(qiáng)果汁益生功能。
雪梨含有豐富的酚類物質(zhì)[5],表現(xiàn)出良好的抗炎及抗氧化活性[6-7]。雪梨制品,如雪梨膏、雪梨漿等,具有清咽潤(rùn)喉的功能[8]。貝母含有多酚[9]、黃酮等多種抗氧化成分[10],具有清熱潤(rùn)肺,化痰止咳等功效[11]。人們常將貝母與雪梨組合食用,強(qiáng)化其益生功能,如:“貝母燉梨”、“貝母蒸梨”、“鮮梨貝母湯”等。
本研究將貝母、雪梨汁二者組合,并添加植物乳桿菌對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵,研究了發(fā)酵過(guò)程中影響抗氧化物質(zhì)多酚、黃酮釋放的主要因素,并基于正交試驗(yàn)對(duì)其工藝進(jìn)行優(yōu)化,開發(fā)出一種具有優(yōu)良抗氧化性能[12-14]的新型功能性飲品。
植物乳桿菌Zw-1:河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心保藏菌株;雪花梨:河北省趙縣;貝母:市售。
蛋白胨(BR)、牛肉膏(BR)、酵母浸粉(BR)、檸檬酸三銨(AR)、亞硝酸鈉(AR)、硝酸鋁(AR)、氫氧化鈉(AR):北京奧博星生物技術(shù)公司;葡萄糖(AR)、乙酸鈉(AR)、磷酸氫二鉀(AR)、碳酸鈉(AR)、鐵氰化鉀(AR)、三氯乙酸(AR):天津市永大化學(xué)試劑有限公司;吐溫80(AR):上海源葉生物科技有限公司;硫酸鎂(AR)、硫酸錳(AR)、無(wú)水乙醇(AR):天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠;蔗糖:市售。
1.3.1 種子培養(yǎng)基
蛋白胨1.0 g,牛肉膏1.0 g,酵母浸粉0.5 g,葡萄糖2.0 g,檸檬酸三銨 0.2 g,吐溫 80 0.1 mL,乙酸鈉 0.5 g,磷酸氫二鉀0.2 g,硫酸鎂0.042 g,硫酸錳0.025 g,調(diào)pH值為6.8~7.0,蒸餾水定容至100 mL。121℃滅菌20 min。
1.3.2 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基
優(yōu)良雪花梨梨汁100 mL,貝母粉(過(guò)40目篩)3 g,蔗糖15g。于85℃水浴滅菌30min,迅速冷卻至40℃。
1.4.1 種子培養(yǎng)
取斜面保藏的植物乳桿菌Zw-1一環(huán),接種于100 mL種子培養(yǎng)基,36℃恒溫培養(yǎng)12 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。
1.4.2 發(fā)酵培養(yǎng)
取5mL種子培養(yǎng)液,接種于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基,36℃恒溫培養(yǎng)51 h。
1.4.3 樣品制備
發(fā)酵貝母-雪梨汁與對(duì)比樣品(貝母-雪梨汁和梨汁)的制備。
發(fā)酵貝母-雪梨汁:取100 mL雪梨汁,加貝母3 g,蔗糖15 g,于85℃水浴滅菌30 min,迅速冷卻至40℃,接入3%種子培養(yǎng)液,于36℃恒溫培養(yǎng)51 h;貝母-雪梨汁制備:取100 mL雪梨汁,加貝母3 g,蔗糖15 g,于85℃水浴滅菌30 min,迅速冷卻至40℃,于36℃恒溫培養(yǎng)51 h;梨汁制備:取100 mL雪梨汁,加蔗糖15 g,于85℃水浴滅菌30 min,迅速冷卻至40℃。于36℃恒溫培養(yǎng)51 h。
1.4.4 發(fā)酵工藝條件的單因素試驗(yàn)
1.4.4.1 植物乳桿菌接種量對(duì)貝母-雪梨汁多酚、黃酮釋放量的影響
取基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基100 mL,以種子培養(yǎng)液接種量為變量,設(shè)置接種量分別為1%、3%、5%、7%、9%,于36℃發(fā)酵培養(yǎng)51h。取上層清液,測(cè)定其多酚、黃酮含量。
1.4.4.2 貝母添加量對(duì)貝母-雪梨汁多酚、黃酮釋放量的影響
取基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基100 mL,以貝母粉添加量為變量,設(shè)置梯度為 1、2、3、4、5 g,于 36 ℃發(fā)酵培養(yǎng) 51 h。取上層清液,測(cè)定其多酚、黃酮含量。
1.4.4.3 蔗糖添加量對(duì)貝母-雪梨汁多酚、黃酮釋放量的影響
取基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基100 mL,以蔗糖添加量為變量,設(shè)置梯度為 5、10、15、20、25 g,于 36 ℃發(fā)酵培養(yǎng)51 h。取上層清液,測(cè)定其多酚、黃酮含量。
1.4.4.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)貝母-雪梨汁多酚、黃酮釋放量的影響
取基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基100mL,于36℃進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),以發(fā)酵時(shí)間為變量,設(shè)置梯度為 31、36、41、46、51 h 。取上層清液,測(cè)定其多酚、黃酮含量。
1.4.5 貝母-雪梨汁正交優(yōu)化試驗(yàn)
以多酚、黃酮釋放量為指標(biāo),選擇貝母添加量、發(fā)酵時(shí)間、植物乳桿菌接種量、蔗糖添加量為單因素,進(jìn)行四因素三水平L9(34)正交試驗(yàn),見表1。
1.5.1 多酚濃度的測(cè)定
采用Folin-Ciocalteu比色法。取1mL樣品于25mL比色管中,加入5 mL蒸餾水,1 mL顯色劑和3 mL 75%碳酸鈉溶液,搖勻,顯色2 h。以蒸餾水代替樣品作為空白對(duì)照。在765 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值,計(jì)算多酚濃度。
表1 因素水平表
Table 1 Factor level table
1.5.2 黃酮濃度的測(cè)定
采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法。取1 mL樣品于10 mL容量瓶,依次加入4 mL 70%乙醇和0.3 mL 5%NaNO2溶液,靜置6min。加入0.3mL10%Al(NO3)3靜置6 min。再加入4 mL 4%NaOH溶液,靜置10 min,用70%乙醇定容。以70%乙醇代替樣品作為空白對(duì)照。在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值,計(jì)算黃酮濃度。
1.5.3 還原力的測(cè)定-普魯士藍(lán)法
取樣品1 mL于試管中,加入2.0 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH 6.6)和1%鐵氰化鉀溶液混勻,50℃水浴反應(yīng)20 min后迅速冷卻至25℃,立即加入2.0 mL 10%三氯乙酸終止反應(yīng)。5 000 r/min離心10 min,吸取上清液2.0 mL,加入2.0 mL蒸餾水和0.4 mL 0.1%FeCl3溶液,混勻,暗室靜置反應(yīng)30 min,于700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值[15]。
植物乳桿菌發(fā)酵貝母-雪梨汁,有利于促進(jìn)多酚、黃酮的釋放,如圖1所示。
由圖1可知,與貝母-雪梨汁相比,植物乳桿菌發(fā)酵后的貝母-雪梨汁中多酚、黃酮含量分別增加了25.71%和16.62%,與雪梨汁相比,貝母-雪梨汁復(fù)合物中多酚、黃酮含量也分別提高了17.37%和9.89%。且發(fā)酵貝母-雪梨汁、貝母-雪梨汁與雪梨汁中多酚、黃酮含量對(duì)比差異顯著(P<0.05)。分析其原因可能為:在長(zhǎng)時(shí)間的浸泡過(guò)程中,貝母細(xì)胞中的多酚、黃酮等有效成分借助于滲透和擴(kuò)散作用,逐漸釋放到梨汁中,使得梨汁中多酚、黃酮含量升高。當(dāng)利用植物乳桿菌對(duì)貝母-雪梨汁進(jìn)行發(fā)酵時(shí),植物乳桿菌可能分泌一些有利于貝母細(xì)胞壁降解的酶系,提高貝母胞內(nèi)物質(zhì)的釋放效率,從而進(jìn)一步提高貝母-雪梨汁中多酚、黃酮的含量。
圖1 不同雪梨汁樣品多酚、黃酮含量比較
Fig.1 Comparison of polyphenols and flavonoids in different pear juice samples
將發(fā)酵貝母-雪梨汁、貝母-雪梨汁和梨汁進(jìn)行梯度稀釋,稀釋后濃度分別為樣品的 1/2、1/4、1/5、1/8和1/10,原樣品濃度設(shè)為1,稀釋濃度以0.1、0.125、0.2、0.25、0.5表示,縱坐標(biāo)為吸光度值。各樣品Fe3+還原力測(cè)定結(jié)果見圖2。
圖2 不同雪梨汁樣品Fe3+還原力測(cè)定結(jié)果比較
Fig.2 Comparison of Fe3+reducing power determination results of different pear juice samples
研究證實(shí),活性成分的抗氧化性能與還原力密切相關(guān),即還原力越強(qiáng),抗氧化活性越強(qiáng)。由圖2可知,發(fā)酵貝母-雪梨汁、貝母-雪梨汁與雪梨汁3種樣品的還原活性,均隨樣品濃度的增大而增大。更重要的是,與浸泡相比,貝母-雪梨汁經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵后,可顯著提高其還原活性,且濃度越高差異越明顯。
李偉偉等[16]研究發(fā)現(xiàn)益生菌發(fā)酵可降低膳食纖維粒徑,使其內(nèi)部結(jié)構(gòu)由原來(lái)致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)變得蓬松易碎;發(fā)酵亦能顯著降低不溶性膳食纖維含量,增加可溶性膳食纖維含量。本試驗(yàn)乳酸菌在以植物類中藥為基質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)時(shí),可能產(chǎn)生相應(yīng)的物質(zhì)定向作用于中藥細(xì)胞壁,促進(jìn)胞內(nèi)有效成分的釋放。由此可知,當(dāng)將植物乳桿菌用于貝母-雪梨汁發(fā)酵培養(yǎng)時(shí),該菌極有可能基于貝母細(xì)胞壁成分產(chǎn)生相應(yīng)的復(fù)合降解酶系,加速貝母細(xì)胞壁破損過(guò)程,促進(jìn)貝母胞內(nèi)多酚、黃酮等有效成分的釋放,從而表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化活性。
為進(jìn)一步提高植物乳桿菌發(fā)酵對(duì)貝母-雪梨汁抗氧化性能的強(qiáng)化作用,本文分別考察了植物乳桿菌接種量、貝母添加量、蔗糖添加量和發(fā)酵時(shí)間等因素對(duì)貝母-雪梨汁多酚和黃酮釋放量的影響。在此基礎(chǔ)上,以貝母-雪梨汁多酚和黃酮釋放量為指標(biāo),基于四因素三水平的正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果,獲得植物乳桿菌發(fā)酵貝母-雪梨汁的最佳工藝條件。
2.3.1 植物乳桿菌發(fā)酵貝母-雪梨汁單因素試驗(yàn)
2.3.1.1 植物乳桿菌接種量對(duì)貝母-雪梨汁多酚、黃酮釋放量的影響
植物乳桿菌接種量對(duì)貝母-雪梨汁多酚、黃酮釋放量的影響見圖3。
圖3 植物乳桿菌接種量對(duì)貝母-雪梨汁多酚、黃酮釋放量的影響
Fig.3 Effect of Lactobacillus plantarum inoculum on the release of polyphenols and flavonoids in fritillaria-pear juice
如圖3所示,在初始接種量較低時(shí),隨乳桿菌接種量的增加,貝母-梨汁發(fā)酵液中多酚和黃酮含量隨之增加;當(dāng)接種量為5%左右時(shí),多酚、黃酮的含量均達(dá)到最大值;當(dāng)接種量超過(guò)5%時(shí),多酚、黃酮含量明顯下降,其中黃酮含量下降尤為明顯。由此可知,乳桿菌接種量將直接影響貝母-梨汁發(fā)酵液中多酚和黃酮的含量。當(dāng)乳桿菌接種量過(guò)低時(shí),發(fā)酵過(guò)程中植物乳桿菌活菌數(shù)過(guò)少,分泌到發(fā)酵體系中的破壁酶系較少,貝母細(xì)胞壁降解不徹底,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)多酚、黃酮等有效成分不能充分釋放。當(dāng)乳桿菌接種量過(guò)高時(shí),發(fā)酵體系中含有較多的植物乳桿菌活菌,一方面發(fā)酵體系中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)用于滿足菌種自生生長(zhǎng)所需,導(dǎo)致相關(guān)酶系合成不足,從而影響貝母細(xì)胞中多酚、黃酮等有效成分的釋放;另一方面,發(fā)酵體系中的多酚、黃酮類物質(zhì)可能被植物乳桿菌作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗掉,導(dǎo)致體系中多酚、黃酮類物質(zhì)含量降低。因此,植物乳桿菌發(fā)酵貝母-雪梨汁時(shí),以5%接種量為最佳。
2.3.1.2 貝母添加量對(duì)發(fā)酵貝母-雪梨汁多酚、黃酮釋放量的影響
貝母和雪梨汁作為主要發(fā)酵基質(zhì),其配比對(duì)發(fā)酵過(guò)程中多酚、黃酮釋放量也有重要影響。本試驗(yàn)以貝母添加量為變量,研究貝母與雪梨汁不同配比對(duì)發(fā)酵過(guò)程中多酚、黃酮釋放量的影響結(jié)果見圖4。
圖4 貝母添加量對(duì)貝母-雪梨汁多酚、黃酮釋放量的影響
Fig.4 Effect of fritillaria addition on the release of polyphenol and flavonoids from fritillaria-pear juice
如圖4所示,當(dāng)貝母添加量小于0.3 g/L時(shí),多酚、黃酮的含量隨貝母添加量的增加而顯著增加;當(dāng)貝母添加量超過(guò)0.3 g/L時(shí),多酚、黃酮的含量則不再上升,整體趨于平衡。這一現(xiàn)象可能是由于在固定的發(fā)酵時(shí)間內(nèi),植物乳桿菌的濃度和分泌產(chǎn)生胞外酶量逐漸趨于飽和,因而多酚、黃酮釋放量不會(huì)隨發(fā)酵基質(zhì)含量的增加而持續(xù)增加。因此,當(dāng)貝母添加量為0.3 g/L時(shí),發(fā)酵體系中多酚、黃酮的含量達(dá)到最優(yōu)值。
2.3.1.3 蔗糖添加量對(duì)發(fā)酵貝母-雪梨汁多酚、黃酮釋放量的影響
蔗糖既可作為植物乳桿菌發(fā)酵的碳源,也可改善發(fā)酵貝母-雪梨汁的口感,因此,在貝母-雪梨汁發(fā)酵體系中以蔗糖作為添加物。蔗糖添加量對(duì)發(fā)酵貝母-雪梨汁多酚、黃酮釋放量的影響見圖5。
圖5 蔗糖添加量對(duì)貝母-雪梨汁多酚、黃酮釋放量的影響
Fig.5 Effect of sucrose addition on polyphenol and flavonoids release in fritillaria-pear juice
如圖5所示,發(fā)酵液中多酚、黃酮含量隨蔗糖添加量的增加,呈現(xiàn)先增加后減小的變化,當(dāng)蔗糖添加量為15%時(shí),發(fā)酵液中多酚、黃酮含量達(dá)到最大值。分析其原因可能為:當(dāng)蔗糖含量過(guò)低時(shí),發(fā)酵體系中乳桿菌數(shù)量較少,分泌產(chǎn)生的降解酶系亦較少。當(dāng)蔗糖濃度過(guò)高時(shí),抑制了植物乳桿菌的正常生長(zhǎng)和胞外蛋白酶的分泌,導(dǎo)致貝母細(xì)胞破壁效果差,限制了多酚、黃酮等有效成分的釋放。
2.3.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)貝母-雪梨汁多酚、黃酮釋放量的影響
植物乳桿菌的生長(zhǎng)發(fā)酵受時(shí)間以及發(fā)酵周期的影響。發(fā)酵時(shí)間對(duì)貝母-雪梨汁多酚、黃酮釋放量的影響見圖6。
圖6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)貝母-雪梨汁多酚、黃酮釋放量的影響
Fig.6 Effect of fermentation time on the release of polyphenols and flavonoids in fritillaria-pear juice
如圖6所示,與上述3種單因素影響不同,植物乳桿菌發(fā)酵時(shí)間對(duì)貝母-雪梨汁中多酚和黃酮釋放量影響并不完全一致。盡管多酚和黃酮釋放量隨發(fā)酵時(shí)間呈現(xiàn)先增加后減少的變化曲線,但發(fā)酵體系中黃酮含量在41 h時(shí)達(dá)到最大值,隨后急劇下降,而多酚含量在46 h時(shí)達(dá)到最大值,滯后于黃酮含量峰值的出現(xiàn)時(shí)間。這一現(xiàn)象可能受多酚、黃酮分子量大小的影響,不同分子量的物質(zhì)從胞內(nèi)釋放速率略有差異。整體而言,發(fā)酵初期隨著發(fā)酵體系中乳桿菌數(shù)量的增加,貝母和雪梨細(xì)胞壁破碎程度增加,大量的多酚、黃酮被釋放到發(fā)酵液中;但隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),底物不斷消耗,部分多酚、黃酮可能被乳桿菌消耗以滿足自身生長(zhǎng)需要,導(dǎo)致發(fā)酵貝母-雪梨汁中多酚、黃酮的含量產(chǎn)生下降趨勢(shì)。
2.3.2 植物乳桿菌發(fā)酵貝母-雪梨汁最佳工藝研究
對(duì)影響貝母-雪梨汁乳桿菌復(fù)合發(fā)酵的貝母添加量(A)、發(fā)酵時(shí)間(B)、乳桿菌接種量(C)和蔗糖添加量(D)4個(gè)因素進(jìn)行三水平正交試驗(yàn)優(yōu)化,以貝母-雪梨汁發(fā)酵體系中的多酚和黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行加權(quán)綜合評(píng)定,試驗(yàn)結(jié)果如表2、表3所示。
表2 正交試驗(yàn)表
Table 2 Orthogonal test table
續(xù)表2 正交試驗(yàn)表
Continue table 2 Orthogonal test table
由表2的結(jié)果可知:以多酚含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí),4個(gè)因素對(duì)發(fā)酵貝母-雪梨汁的影響依次為:發(fā)酵時(shí)間(B)>貝母添加量(A)>乳桿菌接種量(C)>蔗糖添加量(D),多酚含量最高的工藝參數(shù)組合為:A2B2C1D3,即貝母添加量為0.3 g/L,發(fā)酵時(shí)間為41 h,乳桿菌接種量為3%,蔗糖添加量為1.5 g/L。以黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí),各因素對(duì)發(fā)酵貝母-雪梨汁的影響依次為:蔗糖添加量(D)>發(fā)酵時(shí)間(B)>乳桿菌接種量(C)>貝母添加量(A),黃酮含量最高的工藝參數(shù)組合為:A2B2C2D3,即貝母添加量為0.3 g/L,發(fā)酵時(shí)間為41 h,乳桿菌接種量為5%,蔗糖添加量為1.5 g/L。多酚和黃酮含量最高值對(duì)應(yīng)的最優(yōu)工藝參數(shù)組合分別為:A2B2C1D3和A2B2C2D3,二者差異在于C工藝參數(shù)的不同。由表3正交試驗(yàn)方差分析可知,因素C對(duì)發(fā)酵貝母-雪梨汁多酚、黃酮含量的影響為不顯著因素。以C為變量,進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)多酚、黃酮含量最高的工藝組合為A2B2C2D3,即貝母添加量為0.3 g/L,發(fā)酵時(shí)間為41 h,乳桿菌接種量為5%,蔗糖添加量為1.5 g/L,測(cè)得多酚含量為298.75 mg/L,黃酮含量為961.27 mg/L。
由表3正交試驗(yàn)方差分析可知:貝母添加量(A)對(duì)于貝母-雪梨汁發(fā)酵液中多酚和黃酮的含量均有顯著影響;發(fā)酵時(shí)間(B)對(duì)貝母-雪梨汁發(fā)酵液中多酚含量影響顯著;蔗糖添加量(D)對(duì)發(fā)酵液中黃酮含量影響顯著。乳桿菌接種量(C)對(duì)多酚、黃酮含量的影響不顯著。
表3 正交試驗(yàn)方差分析表
Table 3 Orthogonal test analysis of variance
注:*p<0.05差異顯著。
比較不同稀釋濃度(0.1、0.125、0.2、0.5、1)下發(fā)酵貝母-雪梨汁優(yōu)化前后抗氧化能力的變化見圖7。
圖7 植物乳桿菌發(fā)酵貝母-雪梨汁工藝優(yōu)化前后抗氧化能力測(cè)定
Fig.7 Determination of antioxidant capacity of Lactobacillus plantarum fermented fritillaria-pear juice before and after optimization
由圖7可知,優(yōu)化后的植物乳桿菌發(fā)酵貝母-雪梨汁抗氧化能力較優(yōu)化前有明顯提高,樣品濃度越高時(shí),抗氧化效果差距越明顯(p<0.05),與之前測(cè)定的發(fā)酵液中多酚和黃酮類物質(zhì)含量結(jié)果一致。結(jié)果表明,發(fā)酵貝母-雪梨汁新型功能性飲料的抗氧化性能與多酚、黃酮的含量呈正相關(guān),即多酚、黃酮含量越高,抗氧化效果越明顯。
該研究通過(guò)植物乳桿菌發(fā)酵的方式,對(duì)貝母-雪梨汁的抗氧化功能進(jìn)行強(qiáng)化,以生產(chǎn)出具有保健功能的貝母-雪梨汁飲品。結(jié)果發(fā)現(xiàn),乳桿菌發(fā)酵可顯著增加貝母-雪梨汁中多酚和黃酮的含量,與未發(fā)酵組相比二者含量分別提高了33.03%和27.60%,且表現(xiàn)出更好的抗氧化效果。
以多酚和黃酮含量為指標(biāo),通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化獲得植物乳桿菌發(fā)酵貝母-雪梨汁的最佳工藝條件:植物乳桿菌接種量5%,蔗糖添加量1.5 g/L,發(fā)酵時(shí)間41 h,貝母添加量0.3 g/L,最終發(fā)酵貝母-雪梨汁中多酚含量為298.75 mg/L,黃酮含量為961.27 mg/L。發(fā)酵貝母-雪梨汁口感良好,具有良好的抗氧化功能,是理想的新型保健飲品,具有一定的發(fā)展前景。
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