楊桃（Averrhoa carambola L.）屬牻牛兒苗目、科酢漿草科、五斂子屬，俗稱五斂子、三菍、陽桃、洋桃、酸五棱、木踏子、風(fēng)鼓，主要分布于熱帶及亞熱帶地區(qū)，為南方名果，原產(chǎn)于馬來西亞，在我國主要分布于南部地區(qū)，以廣東最多，在臺灣、海南、廣西、福建等省份也有栽植。楊桃的果實(shí)呈五棱形，成熟時(shí)黃綠色至鮮黃色，其果皮非常薄，果肉清脆，可食部分占總體92%以上，是一種新型的低糖類水果[1]，深受消費(fèi)者喜愛。楊桃中含有豐富的糖類、蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸、礦物質(zhì)、纖維素、有機(jī)酸、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)[2-3]及多酚、黃酮等活性成分[4]，有降低血糖、血脂、膽固醇及消除炎癥等作用[5-6]。

多酚是一類具有多酚羥基化合物的總稱，主要分布在水果、蔬菜及谷物等植物中，具有獨(dú)特的抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等生物活性[7-9]，還有抑菌、抗炎、預(yù)防心腦血管疾病等藥理活性[10-11]，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、生態(tài)保護(hù)、農(nóng)業(yè)及化妝品等多個(gè)領(lǐng)域[12]。植物多酚具有供氫能力和結(jié)合自由基的能力，對自由基具有一定的清除能力，是水果中一種主要的天然抗氧化劑。李武等[13]對12種熱帶水果的多酚含量及抗氧化性展開研究，發(fā)現(xiàn)楊桃總酚含量最高，且具有最高的氧自由基吸收能力（oxygenradicalabsorbancecapacity，ORAC）和鐵離子還原能力（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）。在陳晨等[14]的研究中，香蕉皮多酚粗提取物清除羥自由基的能力高于同質(zhì)量濃度的抗壞血酸，而清除DPPH自由基的能力低于抗壞血酸。油脂的氧化酸敗是游離自由基攻擊油脂中不飽和脂肪酸上雙鍵碳原子的連鎖反應(yīng)，在馮航[15]的研究中可知多酚具有抑制油脂中過氧化物形成的作用。

本研究以楊桃為材料，在前期研究基礎(chǔ)上，采用超聲波輔助提取法得到楊桃多酚提取液[16]，通過探究其總抗氧化能力、DPPH自由基清除作用、羥自由基清除作用和油脂過氧化抑制作用來全面測定和評價(jià)其體外抗氧化活性，以期為楊桃及其多酚的綜合和深入開發(fā)利用提供可靠的理論和試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

楊桃：廣東廉江紅唇楊桃，市售；花生油：湛江市麻章區(qū)貴滴食品有限公司。

總抗氧化能力（total antioxidative ability，T-AOC）測試盒：南京建成生物工程研究所；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；七水硫酸亞鐵、水楊酸、30%過氧化氫、氯仿、冰醋酸、碘化鉀、硫代硫酸鈉、沒食子酸、抗壞血酸、無水乙醇、福林試劑、碳酸鈉（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9075A）、電熱恒溫水浴鍋（HWS-24）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；電子天平（AUX320）：日本島津公司；超聲波清洗器（KQ-500V）：昆山市超聲儀器有限公司；低速離心機(jī)（TD-6）：長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；循環(huán)水式真空泵[SHZ-D（Ⅲ）]、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（YRE-5299）：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器（HNY-200B）：天津市歐諾儀器儀表有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 楊桃多酚的提取及其質(zhì)量濃度測定

將楊桃切碎，50℃烘干后粉碎，40目過篩，將得到的樣品置于低溫干燥條件下保存?zhèn)溆谩?zhǔn)確稱取一定量的楊桃樣品于250 mL具塞三角瓶中，按照料液比為1∶50（g/mL），加入適量60%乙醇溶液，采用超聲波頻率為40 kHz、功率為500 W的超聲波清洗器60℃條件下超聲波輔助提取30min后，4000r/min離心15min[16]。取上清液于50℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮[14]后定容至100mL，得到楊桃多酚提取液，采用福林酚法測定楊桃提取液質(zhì)量濃度[17]。

1.3.2 楊桃多酚總抗氧化能力的測定

采用FRAP法按照T-AOC試劑盒說明書檢測總抗氧化能力，分別取濃度為 0.15、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5mmol/L的FeSO4·7H2O 標(biāo)準(zhǔn)溶液 5 μL，各加入 180 μL FRAP 工作液，混勻后37℃孵育4 min，測定其OD593nm。以FeSO4濃度（μmol/L）為橫坐標(biāo)，OD593nm為縱坐標(biāo)，繪制FRAP測定標(biāo)準(zhǔn)曲線[18]。根據(jù)測得的楊桃多酚提取液質(zhì)量濃度，將其稀釋為 10、20、30、40、50、60 μg/mL，同時(shí)以等濃度的抗壞血酸作陽性對照。用移液器取5 μL溶液，加入FRAP工作液180 μL，混勻后37℃孵育4 min，測定其OD593 nm。將其代入FRAP測定標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到其所對應(yīng)的FeSO4濃度，繪制關(guān)系曲線，樣品的總抗氧化能力以FRAP值表示，即總抗氧化能力相當(dāng)于FeSO4的 μmol/L 數(shù)[19]。

1.3.3 楊桃多酚提取液清除羥自由基能力的測定

根據(jù)鄭菲[20]的水楊酸法稍加修改?？疾觳煌姆磻?yīng)溫度（30、40、50、60、70、80 ℃）條件下，加入不同體積的楊桃多酚提取液（0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL）的羥自由基清除能力。固定在試管中加入1 mL 6 mmol/L硫酸亞鐵和1 mL 6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，加入不同體積的楊桃多酚提取液和適量的蒸餾水，保證反應(yīng)體系為5 mL。將其置于試驗(yàn)溫度中預(yù)熱3 min，再加入1 mL的6 mmol/L H2O2，反應(yīng)10 min后測定其OD510 nm值A(chǔ)X，以蒸餾水代替樣品為空白測定OD510 nm值A(chǔ)O，同時(shí)以等濃度的抗壞血酸溶液作陽性對照[21]。羥自由基清除率可用公式（1）表示。

1.3.4 楊桃多酚提取液清除DPPH自由基能力的測定

根據(jù)Monica等[22]的方法稍作修改。取不同體積（10、20、30、40、50、60 μL）的楊桃多酚提取液，加入4 mL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液，加入蒸餾水至8 mL，混勻后放置30 min，于517 nm處測定其OD值A(chǔ)X；取4 mL蒸餾水與4 mL DPPH溶液混勻，測定其OD值A(chǔ)O；取4 mL乙醇與4 mL蒸餾水混勻作空白。同時(shí)以同濃度的抗壞血酸作為陽性對照組。DPPH自由基清除率可用公式（2）表示。

1.3.5 楊桃多酚提取液對花生油過氧化抑制作用的研究

1.3.5.1 不同質(zhì)量濃度的楊桃多酚提取液對花生油的過氧化抑制作用

稱取 12g花生油，加入不同濃度（0、0.5、0.625、0.83、1.25、2.5、5.0 mg/mL）的楊桃多酚提取液 1 mL，同時(shí)以加入相同濃度的抗壞血酸為陽性對照，置于55℃的恒溫振蕩器中，分別測定其第3天的過氧化值[23]。過氧化值的測定參考GB 5009.227-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中過氧化值的測定》[24]。

1.3.5.2 添加楊桃多酚提取液不同的反應(yīng)時(shí)間對花生油過氧化抑制作用

分別測定加入一定濃度楊桃多酚提取液的花生油在第3天、第6天和第9天的過氧化值，同時(shí)以加入相同濃度的抗壞血酸為陽性對照。具體步驟和方法同1.3.5.1。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，最終取其數(shù)據(jù)平均值。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯著性分析。單因素方差分析兩兩間顯著性檢驗(yàn)采用最小顯著差異法（least significance difference，LSD）法，P=0.05為顯著性水平。兩組間顯著性檢驗(yàn)采用配對樣本t檢驗(yàn)的分析方法，P<0.05即認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊桃多酚提取液的質(zhì)量濃度

試驗(yàn)得出以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品的總酚含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=1.379 8x-0.016 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 1。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

由圖1可知，采用沒食子酸作為總多酚測定的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)時(shí)，其在765 nm處的吸光度OD765nm與其濃度呈良好的線性關(guān)系。測定楊桃多酚提取液的吸光度值，根據(jù)以上沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，可得楊桃多酚提取液的濃度為5.2 mg/mL。后續(xù)總抗氧化能力、羥自由基清除能力及DPPH自由基清除能力試驗(yàn)中所使用的楊桃多酚提取液均是以此濃度楊桃多酚提取液稀釋一定倍數(shù)得到的溶液。

2.2 楊桃多酚提取液總抗氧化能力

2.2.1 FRAP法測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
Fig.1 The standard curve of gallic acid

試驗(yàn)確定了以FeSO4·7H2O為標(biāo)準(zhǔn)品的FRAP測定標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.000 06x+0.002 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.992 2。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。FeSO4濃度在0～1 500 μmol/L范圍內(nèi)與其在593 nm處的吸光度具有良好的線性關(guān)系。

圖2 FRAP測定標(biāo)準(zhǔn)曲線
Fig.2 The standard curve of FRAP

2.2.2 楊桃多酚提取液的總抗氧化能力

不同質(zhì)量濃度的楊桃多酚提取液和抗壞血酸溶液總抗氧化能力的試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

根據(jù)2.2.1所得的FRAP測定標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算在FRAP測定中楊桃多酚提取液和抗壞血酸溶液測得的OD值所對應(yīng)的FeSO4濃度。x為楊桃多酚提取液質(zhì)量濃度，y為FeSO4濃度，試驗(yàn)測得抗壞血酸溶液的線性回歸方程為y=18.099x+15.278，相關(guān)系數(shù)R2=0.999；楊桃多酚提取液的線性回歸方程為y=14.488x-32.341，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 3。結(jié)果表明，在研究的濃度范圍內(nèi)，楊桃多酚提取液和抗壞血酸的總抗氧化能力隨著其質(zhì)量濃度升高而增加，且均存在很好的線性關(guān)系。經(jīng)測算，5.2 mg/mL楊桃多酚提取液總抗氧化能力的FRAP值為72 103.5 μmol/mL，相同濃度的抗壞血酸溶液總抗氧化能力的FRAP值為95 642.6 μmol/mL。此外，在研究的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸的總抗氧化能力高于楊桃多酚提取液。

圖3 不同質(zhì)量濃度的楊桃多酚提取液和抗壞血酸溶液的總抗氧化能力
Fig.3 Total antioxidant capacity of carambola polyphenols extract and ascorbic acid solution in different mass concentration

2.3 楊桃多酚提取液對羥自由基的清除作用

2.3.1 不同體積的楊桃多酚提取液對羥自由基的清除作用

在30℃的反應(yīng)溫度條件下，同一質(zhì)量濃度的不同體積楊桃多酚提取液和抗壞血酸溶液對羥自由基清除作用的結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同體積的楊桃多酚提取液和抗壞血酸溶液對羥自由基清除作用的影響
Fig.4 Effect of different volume of carambola polyphenol extract and ascorbic acid solution on hydroxyl free radical scavenging capacity

由圖4可知，楊桃多酚提取液和抗壞血酸溶液對羥自由基的清除能力在一定范圍內(nèi)隨著體積的增加而增強(qiáng)。差異性分析表明，當(dāng)抗壞血酸溶液體積低于1.5 mL以及楊桃多酚提取液的體積在研究的體積范圍內(nèi)，各體積間的羥基自由基清除率差異顯著（P＜0.05）。一定濃度的抗壞血酸對羥自由基的清除率在體積小于1.5 mL時(shí)呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢，當(dāng)體積為1.5 mL時(shí)抗壞血酸對羥自由基的清除率達(dá)99%以上，羥自由基基本已被清除。在研究的體積范圍內(nèi)，隨著楊桃多酚提取液體積的增加，羥自由基清除率逐漸增加，最高可達(dá)90%以上，說明楊桃多酚提取液有良好的自由基清除能力。此外，同一質(zhì)量濃度條件下，楊桃多酚提取液清除羥自由基的能力均低于相同濃度的抗壞血酸溶液。

2.3.2 楊桃多酚提取液在不同溫度條件下對羥自由基的清除作用

在不同溫度條件下，相同體積且相同質(zhì)量濃度的楊桃多酚提取液和抗壞血酸溶液對羥自由基清除能力的影響結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同溫度對楊桃多酚提取液及抗壞血酸清除羥自由基作用的影響
Fig.5 Effects of different temperatures on the hydroxyl radical scavenging capacity of carambola polyphenol extract and ascorbic acid solution

由圖5可知，在一定溫度范圍內(nèi)，楊桃多酚提取液與抗壞血酸溶液對羥自由基的清除率隨著溫度的升高而逐漸升高。此外，同一溫度條件下，楊桃多酚提取液清除羥自由基的能力略低于相同濃度的抗壞血酸。

2.4 楊桃多酚提取液對DPPH自由基的清除作用

同一質(zhì)量濃度的不同體積楊桃多酚提取液和抗壞血酸溶液對DPPH自由基的清除作用結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，在一定體積范圍內(nèi)，隨著體積的增大，楊桃多酚提取液和抗壞血酸溶液對DPPH自由基的清除率逐漸增加。顯著性差異分析表明，當(dāng)抗壞血酸溶液體積低于40 μL以及楊桃多酚提取液體積低于50 μL時(shí)，各體積間的DPPH自由基清除率差異顯著（P＜0.05）。當(dāng)抗壞血酸溶液添加量為40 μL時(shí)，DPPH自由基的清除率達(dá)90%以上，繼續(xù)增加抗壞血酸溶液體積，其DPPH自由基清除率不再增加；楊桃多酚提取液的添加量為50 μL時(shí)的清除率可達(dá)到80%以上，繼續(xù)增大體積，其DPPH自由基清除率也不再增加。另外，在相同質(zhì)量濃度條件下，楊桃多酚提取液對DPPH自由基的清除能力略低于抗壞血酸。

圖6 不同體積楊桃多酚提取液和抗壞血酸溶液對DPPH自由基清除作用的影響
Fig.6 Effectsofdifferentvolumesolutionsofcarambolapolyphenol extract and ascorbic acid solution on DPPH free radical scavenging capacity

2.5 楊桃多酚提取液對花生油的過氧化抑制作用

2.5.1 不同質(zhì)量濃度的楊桃多酚提取液對花生油的過氧化抑制作用的影響

在55℃反應(yīng)溫度條件下，添加不同濃度的楊桃多酚提取液和抗壞血酸溶液的花生油在第3天的過氧化值（peroxide value，POV）如圖7所示。

圖7 添加不同濃度的楊桃多酚提取液和抗壞血酸溶液對花生油過氧化值的影響
Fig.7 Effects of different adding concentration of carambola polyphenols extract and ascorbic acid solution on the peroxide value in peanut oil

油脂的過氧化值表示油脂被氧化程度，測得花生油的POV越大，其所含有的過氧化物越多，表示被氧化程度越大。由圖7可知，添加不同濃度的楊桃多酚提取液和抗壞血酸溶液的花生油POV值均小于空白組的花生油POV值。

添加不同濃度多酚提取液和VC溶液的花生油POV值的雙樣本配對t檢驗(yàn)結(jié)果見表1。

由表1可知，添加不同濃度的楊桃多酚提取液和抗壞血酸溶液的花生油與其空白組的POV值均差異顯著（表1中1、2配對組的P＜0.05），說明添加不同濃度楊桃多酚提取液和抗壞血酸溶液對花生油中過氧化物的生成具有一定的抑制作用。另外，隨著楊桃多酚提取液和抗壞血酸溶液添加濃度的增加，花生油中過氧化物的含量越低，說明在研究的添加濃度范圍內(nèi)，楊桃多酚提取液和抗壞血酸溶液對花生油中過氧化物生成的抑制作用隨著添加濃度增加而增強(qiáng)。表1中的第3組配對組P＜0.05，說明添加不同濃度的楊桃多酚提取液和抗壞血酸溶液的花生油POV值差異顯著，即兩者對花生油過氧化抑制效果差異顯著。在相同質(zhì)量濃度條件下，添加楊桃多酚提取液的花生油POV值均高于添加了抗壞血酸的花生油，說明楊桃多酚提取液對花生油的過氧化抑制作用弱于抗壞血酸溶液。

表1 添加不同濃度多酚提取液和VC溶液的花生油POV值的雙樣本配對t檢驗(yàn)結(jié)果
Table 1 Two sample paired t-test of adding different concentration of carambola polyphenols extract and ascorbic acid solution on the analysis of POV value in peanut oil

2.5.2 不同反應(yīng)時(shí)間對添加楊桃多酚提取液的花生油過氧化抑制作用的影響

不同反應(yīng)時(shí)間對楊桃多酚提取液和抗壞血酸溶液的花生油POV值的影響結(jié)果如圖8所示。

隨著時(shí)間的增加，空白組和其他處理組的花生油POV值逐漸上升，但添加了楊桃多酚提取液和抗壞血酸溶液的花生油POV值均小于空白組的花生油，空白組的花生油與添加楊桃多酚提取液和抗壞血酸溶液的花生油中POV值的差值隨著時(shí)間增加而增大。

不同的處理組花生油貯藏3、6、9 d POV值的雙樣本配對t檢驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2可知，空白組和其他所有處理組的花生油POV 值差異顯著（表 2中 1、2、3、4配對組 P＜0.05），說明在研究的貯藏時(shí)間范圍內(nèi)，楊桃多酚提取液和抗壞血酸溶液對花生油中過氧化物的生成具有一定的抑制效果，并且隨著時(shí)間的增加這種抑制效果增強(qiáng)。表2中的7、8配對組P＞0.05，說明不管是添加稀釋2倍多酚提取液和VC溶液還是未稀釋的多酚提取液和VC溶液的花生油，反應(yīng)不同的時(shí)間，其POV值差異不顯著，即兩者對花生油過氧化抑制效果差異不顯著。

圖8 不同反應(yīng)時(shí)間對添加楊桃多酚提取液和抗壞血酸溶液的花生油過氧化值的影響
Fig.8 Effects of different reaction time on the peroxide value of peanut oil adding carambola polyphenols extract and ascorbic acid solution

表2 不同的處理組花生油貯藏3、6、9 d POV值的雙樣本配對t檢驗(yàn)結(jié)果
Table 2 Two sample paired t-test of different treatment group storing for 3 d，6 d and 9 d on the analysis of POV value in peanut oil

3 討論與結(jié)論

對于抗氧化活性的測定方法有多種，所對應(yīng)的反應(yīng)原理也各不相同，各具優(yōu)缺點(diǎn)，為了獲得準(zhǔn)確和全面的評價(jià)結(jié)論，需采用多種方法進(jìn)行測定。本研究從總抗氧化能力、清除羥自由基和DPPH自由基能力和油脂過氧化抑制能力等方面對楊桃多酚提取液的抗氧化活性進(jìn)行測定和評價(jià)，同時(shí)采用抗壞血酸溶液作陽性對照，能較全面地評價(jià)楊桃多酚提取液的體外抗氧化活性。

在總抗氧化能力方面，5.2 mg/mL楊桃多酚提取液總抗氧化能力的FRAP值為72 103.5 μmol/mL，質(zhì)量濃度與其總抗氧化能力存在很好的線性關(guān)系。在陳玉霞等[19]的研究中，質(zhì)量濃度為10 mg/mL的41種中草藥超聲波乙醇提取液的總抗氧化能力的FRAP值在5 μmol/mL～800 μmol/mL，楊桃多酚提取液的總抗氧化能力明顯高于41種中草藥。在清除羥基自由基方面，隨著楊桃多酚提取液體積的增加，羥自由基的清除率逐漸增加，羥自由基的清除率最高可達(dá)90%以上，說明楊桃多酚提取液對羥基自由基的清除效果很好。在清除DPPH自由基能力方面，楊桃多酚提取液能清除80%以上的DPPH自由基，在李寧[25]對青莢葉多酚的研究中，青莢葉的粗多酚對DPPH自由基最大清除率為62%，與之相比，楊桃多酚提取液對DPPH自由基的清除效果較好。在花生油過氧化抑制作用方面，在研究的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，楊桃多酚提取液對花生油中過氧化物的生成具有一定的抑制作用。但是楊桃多酚提取液的總抗氧化能力、清除羥自由基和DPPH自由基能力以及抑制花生油中過氧化物的生成能力均稍弱于同濃度的抗壞血酸。

綜上所述，楊桃多酚提取液具有較好的總抗氧化能力、清除羥自由基和DPPH自由基能力以及一定的抑制花生油中過氧化物的生成能力，也是一種有效的天然抗氧化性物質(zhì)。由于本試驗(yàn)研究的楊桃多酚提取液是粗提液，未經(jīng)過分離和純化，其總抗氧化能力、清除羥自由基和DPPH自由基能力、抑制花生油中過氧化物生成的能力均稍弱于同濃度的抗壞血酸，若對楊桃多酚提取液進(jìn)一步的分離純化，其活性可能會進(jìn)一步增加，這也是本研究進(jìn)一步深入研究的一個(gè)重要方向。